冷冻超薄切片免疫标记技术，常采用 Tokuyasu 糖包埋冷冻切片免疫标记技术。在蔗糖保护后解冻了的冷冻超薄切片上进行免疫标记过程，既保证了超微结构，又使蛋白抗原性保持在良好状态。与树脂包埋的方法相比，Tokuyasu 糖包埋冷冻切片免疫标记技术更适用于比较敏感的抗原。该技术的局限性在于需要特殊的仪器以及专业的技术人员，而且冷冻超薄切片的难度相对比较大，切片面积较小，不适合观察较大范围的结构。

由于生物样品的多样性，免疫电镜样品的固定和制备方法也不尽相同。下面先介绍免疫标记样品的固定和制备过程中需要注意的一些关键问题。
2.1 固定

样品的固定过程就是将细胞的生命活动迅速终止的过程，在这个过程中稳定细胞器等亚细胞结构的相对位置，尽可能真实的反映生物组织或细胞超微结构。
      （1）固定液概述

免疫电镜的固定需要满足以下两个条件:第一，将生物过程终止在所需的状态；第二，抗原活性的保存以及暴露于抗体能够识别的部位。实际操作中这两个条件经常是矛盾的，维持好的超微结构需要迅速而有效的固定，而这样的固定过程通常会破坏蛋白的抗原性，使抗 原不能被抗体识别，而且较强的固定会引起蛋白交联，使得细胞变得比较致密，从而影响免疫试剂的渗透效果。因此，如何协调好这个矛盾是保证免疫电镜成功率的关键。

生物样品的有效固定取决于固定的速度。通常小分子(如甲醛)比大分子(如戊二醛) 浸透速度要快。高浓度的醛类会引起细胞膨胀，因此如果需要使用高浓度的固定液，可以通过先使用低浓度固定液，如 2%甲醛，再增加固定液浓度到所需终浓度来解决细胞膨胀的问题。由于甲醛分子较小，穿透力强，是保持生物样品良好抗原性的最佳选择。样品经过甲醛固定后，其结构也可以得到良好保存。但是需要注意的是，甲醛固定会发生部分复性，如果将甲醛固定后的样品 长期储存于没有固定剂的缓冲液中，会导致超微结构保存不佳。另外， 甲醛属于比较弱的固定剂，只能保持一定的超微结构。因此，在甲醛固定剂中加入适量的戊二醛可以改善生物样品的超微结构。虽然戊二醛可以很好的保存生物样品的形态结构，但在实际操作时，首先要注意的是，不同组织选择固定的时间应有所不同。其次，免疫电镜固定液中戊二醛的浓度是可调的，要根据不同的抗原来决定戊二醛的浓度。我们通常混合使用 2%甲醛和 0.01%到 0.5%戊二醛，这样的组合不 但可以尽量保持蛋白的抗原活性，而且生物样品良好的超微结构也得以保存。

1.固定液的 pH 值:在样品固定过程中，溶液的 pH 值应该维持在生理状态。醛类会影响溶液的 pH 值，因此选用缓冲能力较强的缓冲液来配制固定液很重要。使用 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(PB)以及 HEPES 或 PIPES 缓冲液来配固定液比使用生理盐水(含 0.9%氣化钠) 或 PBS 缓冲液要好。二甲胂酸钠作为传统的缓冲液，虽然毒性比较大，但是由于其稳定性好、缓冲力强，至今还是很多电镜室的首选。对于体外培养的细胞，有些实验室将固定液直 接加人细胞培养液中以使细胞在最好的生理条件下固定。需要注意的是 Tris 不适合配制固定液，因为它的氨基可以和醛基结合从而阻断醛类的固定作用。对于细胞中特殊结构的固定， 例如细胞骨架，可以在缓冲液中加人适当浓度的 MgCl2，KC1 和 EGTA。

2.固定温度:生物样品的固定对于超微结构的维持非常重要。理论上低温固定有利于减 少细胞的自溶以及减缓细胞内的各种活动，然而在接近细胞或组织的生理温度 (20-37°C)时， 固定液的渗透速度是最快的。因此，具体采用什么温度进行固定需要根据具体情况而定。一 般来说，应该选用最接近所要固定样品的实际温度，避免过冷或过热，保证固定液以最快的速度进人组织或细胞，同时蛋白质的交联也更有效。在固定液中被固定的样品可以在 4°C冰 箱保存较⻓时间(大约两周)。

3.固定液的渗透压:动物体内生理条件的渗透压大约为 360 mOsm，选用相同渗透压的缓冲液是最理想的固定条件。
       (2) 固定时间

       不同样品的固定时间不同，取决于组织的种类及大小、抗原的特性、固定液的种类和浓度，以及固定液的温度等。一般来说，含有戊二醛的混合固定液可以采用室温或 37°C固定 2h。单独的甲醛固定液通常采用 4°C固定 4h 或者过夜。过⻓的固定时间并不能更好的保存生物组织的超微结构，相反对于免疫电镜的样品来说还会影响其抗原活性，并且会使样品变硬，继而影响冷冻切片的质量。

       (3) 固定过程

       固定过程主要考虑的是固定速度。要注意的是固定之前不要对生物样品做过多的处理,以免影响样品的超微结构。

       (4) 固定样品的储存

经过甲醛和戊二醛固定过的样品可以储存在含有1%甲醛的缓冲液中，以防甲醛的作用减弱。长期储存在甲醛溶液中的样品并不会影响其抗原性，但是组织会变硬，影响冷冻切片。 经过戊二醛固定的样品可以在缓冲液中储存一定的时间（两周）。需要冷冻切片的样品也可以在 2.3mol/L 蔗糖 (sucrose)（磷酸盐缓冲液配制）中于 4°C储存一定的时间（两周），但储存时间加长会引起组织变脆。如果有条件，最好将需要冷冻切片的样品保存在液氮中。

       (5) 固定样品的邮寄

固定后的样品在运输尤其是空运过程中可能会有冰晶的形成，导致样品超微结构被破坏，因此在邮寄过程中的固定液应该用 1%甲醛加至少 1.8mol/L 的蔗糖；或者用含有湿冰的保温盒进行邮寄，以确保低温邮寄过程中样品不会结冰。

2.2 样品的处理

       (1) 贴壁细胞

贴壁细胞最好是培养在 6cm 或10cm的细胞培养盘中，这样比较容易刮取细胞。固定前一天，需要换新鲜的培养液，固定液的体积准备需要量的 3 倍以上。
       (2) 悬浮培养物

悬浮培养的细菌、酵母或非贴壁细胞的固定方法是将两倍浓度的固定液按体积比 1:1 直接加入培养液中，使终浓度为正常的固定液浓度。样品自然沉淀，或者如果需要可选择 100-150g 低速离心。去除上清液，将沉淀重新悬浮在正常浓度的固定液中，转移到离心小管中继续固定。

       (3) 组织