由于生物样品抗原的多样性，很多蛋白质经过脱水及树脂包埋后，其高级结构发生变化，造成抗体无法与抗原结合。不同于组织石蜡包埋切片的免疫标记，电镜树脂包埋的样品无法用微波加热的方法来使抗原复性，因此很多能够运用在石蜡切片免疫标记中的抗体不能有效用于标记常温树脂包埋的样品。而冷冻超薄切片技术最大限度地保存了抗原的原始结构，更有利于抗体识别并与之结合。理论上讲，只要在光镜冷冻切片上能有效标记的抗体，运用在电镜冷冻超薄切片的免疫标记都是可行的。

尽管冷冻超薄切片技术的首创可以追述到上世纪五士年代初，但如何防止低温下冰晶形成并保持生物样品的超微结构一直是冷冻过程中需要解决的大问题。直到 1973 年 Tokuyasu 的两大改进才使冷冻样品的超微结构和切片质量有了显著改善和提高，使得该技术的普遍应用成为可能（Tokuyasu，1973）。这两大改进分别是使用蔗糖做为冰冻保护剂，以及捞取切片方法的改进。1978年，Tokuyasu又使用甲基纤维素（metbyl celluilose）保护冷冻切片，避免了切片在溶化过程中表面张力造成的超微结构破坏 （Tokuyasu，1978），进一步完善了该技术。

固定后的生物样品需要进行以下几个步骤进行冷冻超薄切片的免疫标记:

3.1 冷冻保护

冰晶的形成会破坏细胞或冷冻超薄切片超微结构。生物样品只有在玻璃态(vitreous) 下才可以切出好的冷冻切片。一般情况下，冷冻速度要达到亳秒级才能防止冰晶形成，也就是说含水冷冻只限于样品的表面。冷冻厚度在没有保护剂的情况下最多可以达到大约 10um 左右。在高压的条件下，含水冷冻可以达到几百 HT（通常为 200 pI）。Tokuyasu 等人指出，生物样品浸透于一定浓度的蔗糖中可以防止在冷冻过程中形成冰晶。蔗糖是亲水的大分子化合物，它很容易浸透固定后的细胞膜，即使在 2.6mol/L 这样很高的浓度下也不会影响组织的结构和抗原活性 （Tokuyasu，1973）。Griffiths 等人于 1984 年发现，1.8mol/L 或更高浓度的蔗糖在慢速冷冻的时候会冻得比较均匀(Griffiths 等，1984)。由此可见，蔗糖可以用做冷冻保护剂。此外，高浓度的蔗糖增加了冷冻块的可塑性，当切片温度降低的时候，冷冻切片仍然可以保持平整和光亮。我们在实验过程中，使用 2.3mol/L 蔗糖溶于 HEPES 或者 PBS 缓冲液中做为冷冻保护剂和组织包埋剂。另外，使用 15-20%的聚乙烯吡咯烷酮 （polyvinylpyrrolidone， PVP-10）也可以改善切片条件 （Tokuyasu，1989）。

3.2 蔗糖浸透
       切成小块的生物样品用梯度浓度的蔗糖液进行浸透。室温下在 0.5 mol/L 和 1mol/L 蔗糖液中分别浸透 10min，然后转移到 2mol/L  蔗糖液中浸透 2h，最后转移到 2.3mol/L 蔗糖液中浸透 2h 或 4°C过夜。所有的浸透过程都在摇摆仪（rotator）上进行。摇摆仪摇动的速度、角度和蔗糖溶液上方留存空气的体积均须调整，确保小管在摇动的过程中空气不只是停留在小管的上部。通常留存在小管中的空气空间应该小到一定程度，当小管摇动时其中的空气可以上下运动。如果蔗糖溶液中加入了 PVP-10，那么浸透时间需要延长，但不能超过 48h。
3.3 样品的冷冻

       (1) 样品台(pins)的准备

样品台通常可以从超薄切片机销售商或者从 EMS（Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA，US）购买。样品台有平头和凹槽两种类型，根据需要选用不同类型。新买的样品台需要放入洗涤液中用超声清洗5 min，然后再用清水冲洗干净，最后放入纯酒精中以便去除残留的油迹和金属残留物，晾干备用。使用前要在显微镜下仔细检查样品台的表面， 任何残留的金属都有可能毁掉贵重的钻石刀。使用过的样品台可以用去离子水清洗后晾干重复使用。

       (2) 样品的安装

经蔗糖浸透的样品用小环或类似的用具转移到样品台上，在体视显微镜下将样品调整到适于切片的位置。如果样品比较大，可以先切小后再放置于样品台上。用滤纸将多余蔗糖溶液吸掉，只留下很薄的一层蔗糖溶液在样品四周。这个过程要快，以防产生蔗糖晶体。

       (3) 样品的冷冻和存储

置于样品台上的样品可以立即放于液氮中冷冻，然后转移到冷冻切片机的冷冻室中静置5 到 10 min 以确保温度达到预设温度，然后进行冷冻超薄切片。冷冻安装于样品台上的样品也可以放在写好标记的冷冻小管中，在液氮罐中长期储存。另外，冷冻之后的蔗糖应该是透亮的，如果冷冻的样品变得浑浊不透亮，则可能是蔗糖的浓度太低，有可能形成冰晶影响切片的质量。冷冻样品可以在液氮中储存数年，但是储存时间过久会使样品表面干燥而影响切片的质量。解决办法是将样品重新放在蔗糖液中浸透并重新安装和冷冻。
3.4 冷冻超薄切片

       (1) 切片机的设置

将用于连接切片机的液氮罐提前充满，这样有利于切片时液氮的稳定输出。按照切片机说明将冷冻室和切片刀设到合适的温度（-90°C到 -130°C)，将冻于样品台上的样品固定到样品支持杆上，等待温度稳定于设置温度。修快和切片开始之前务必再次检查，确保样品座和 切片刀已固定紧。

       (2) 修块

修块可以选用 45°的玻璃刀，也可以用钻石修块刀进行修块。修块时，刀和样品以及冷室的温度均设置在-80°C 到 -100°C（通常选用 -80℃）。将样品小心靠近刀口，使其长边与刀口平行，然后用 100nm/s 较高的速度将样品表面修平，使样品暴露出来。通常表面修块深度大约为 100um，修好的样品块表面为正方形或长方形，呈现光亮的颜色。修掉的样品废料可以用冷室的氮气吹走。也可以用少许液氮倒在刀和样品上清理修块产生的废物，但是由于液氮的温度低于样品和刀的温度，需要等待温度稳定之后再行切片。当然也可以用沾有蔗糖的小环来清理刀面，但这需要特别小心，避免伤及刀刃。

       (3) 半薄切片

用玻璃刀切的半薄切片厚度大约为 0.15-0.2um ，前几片可能看起来雪雾状，意味着切的是用于包埋样品的蔗糖本身。当光亮切片出现的时候，就意味着切到组织了。单个半薄切片用直径 3mm 沾有 2.3mol/L 蔗糖的小环沾起，当沾有蔗糖的小环进入低温切片室时蔗糖会呈现烟雾状。一旦烟雾停止，立即将含有几乎冰冻状态蔗糖的小环接近切片，切片会沾到小环中的蔗糖上而伸展开来。如果在接近切片之前蔗糖已经完全冷冻的话，可以将小环移到室温，待蔗糖溶化后再重新放入切片室沾取切片。切片沾到小环上后，将带有切片的小环 从低温切片室移到室温，待蔗糖溶化后，将小环切片面朝向载玻片，在载玻片上沾一下， 切片就被转移到载玻片上了。将有切片的载玻片放置于 60℃ 的烤片台上，滴加 1% 的甲苯胺蓝（toluidine blue） 水溶液，染色 1min 后在显微镜下观察。切记不要用酒精或其他有机溶剂配制的染液来染色，因为有机溶剂会使切片脱离载玻片。转移切片的小环用蒸馏水彻底冲洗干净，晾干后再沾取另外的切片。在用小环沾取蔗糖时，蔗糖的体积需要调节到中等大小，液滴呈椭圆型而不是圆形。蔗糖体积越大，使其达到半冷冻状态所需要的时间越长，就越难调节蔗糖滴的可塑性。 相反，如果蔗糖液滴体积太小进入切片室后会很快凝结，极易对切片造成损坏。半薄切片可以用来做免疫萤光标记。萤光标记不仅可用于检测抗体的质量，同时半薄切片在普通荧光显微镜下的分辨率甚至好于一般的共聚焦显微镜。

       (4) 精细修快

一旦找到了合适的部位，样品块需要继续修到更小的表面积。样品块表面积越小切片越容易。样品块的边缘应该修得很直，相对应的两条边一定要平行，确保表面呈正方形或长方形，而不是多边型。一般情况下，样品块的表面积为 0.3 mm×0.3 mm 到 0.4 mm×0.4 mm 最适合切片。

       (5) 超薄切片

将制作良好的玻璃刀或钻石刀移到修好的样品块前，确认样品块和刀都没有松动。将样品、刀和切片室的温度均调到 -120℃ 。在这样的温度下使用钻石刀，大多数 2.3mol/L 蔗糖浸透的样品都能得到很好的切片，但是也有例外，如果在-120℃ 不能得到良好的切片，可以调整切片温度，一般生物样品的切片温度都应该介于-90℃ 到 -150℃ 之 间。温度的高低取决于样品材料本身特性以及切片的厚度。在 推动样品块靠近刀刃时，应该使用后灯或底灯， 每次前进 0.1 到 0.5um。通常冷冻超薄切片的厚度设置为 60nm 到 90nm。加入微量戊二醛固定的样品可以切出较薄的片子，而单用多聚甲醛固定的样品切出的片子相对较厚。实际切片的厚度就像树脂包埋的切片一样，可以根据切片的颜色来判断。切片的速度设置为每秒 1.2 到 1.6mm。切出的片子应该是光亮的，如果切片是浑沌(dull)不透亮的，有可能是切片有压缩或有颤痕。在切片过程中，有压缩是正常现象，一般的压缩比例是 30% 到 60% 。当切片以一定的厚度稳定地切一段时间后，切片的实际厚度与设置厚度不一定绝对相同。由于充满低温氮气的空间非常干燥，切片时切片刀常带有电荷。解决办法是用睫毛针沾上距离刀口最远端的切片，将切片提起离开刀面使其伸展。用钻石刀切片的话静电问题尤为严重，静电对于钻石刀的影响可以通过调节切片机自带的离子发生仪的强度来解决，小心调节离子发生仪的强度，可使切片从刀口顺利滑下，便于用睫毛针沾取。建议选用钻石刀进行冷冻超薄切片。

       (6) 切片的捞取

当切出相对平整、压缩很少的切片(最好是连续切片)后， 需要将切片转移到远离刀口处便于捞取。转移切片的过程需要关闭离子发生仪，用眉毛针轻轻沾上连续切片中距离刀口最远端的切片将其拖离刀口，放到切片刀的斜面上。连续切片的长度要小于转移捞片小环的半径，以便切片随着蔗糖融化时有足够的空间伸展。与捞取半薄切片的方法类似，将不锈钢制作的小环浸入 2.3mol/L 的蔗糖缓冲液中，提起小环后得到椭圆形的蔗糖滴。蔗糖液滴的大小很关键，通常慢提得到的蔗糖滴体积小，快提则液滴体积大。若液滴体积太大，冻结所需的时间则太长。 通过切片机上的显微镜观察，将沾有蔗糖滴的小环移到冷室中， 让液滴靠近切片，但是不要碰到切片。当观察到液态蔗糖不再冒气时，将液滴轻轻压到切片上，迅速提起小环移出冷冻室，等待蔗糖融化。蔗糖融化后可以看到切片，如果仔细观察，甚至能够看到切片在蔗糖融化过程中的伸展过程。

当蔗糖完全融化后，将切片朝下沾到附有方华膜和碳膜的载网上，然后将“小环-切片-载网三明治”转移到 6cm 的培养盘内含有 0.5%多聚甲醛的 2mol/L 蔗糖滴上（切片面朝向蔗糖），同一个培养盘内可以放很多含有切片的蔗糖滴。也可以将带有切片的载网转移到铺有 2%琼脂制作的 6cm 培养皿内。注意铺有琼脂的培养皿要放置于冰上操作。切好的切片可以在 4°C保存一周。载网通常应该选用镍网，因为铜网容易生锈，如果切片后马上用于后续标记实验的话，选择铜网也可以。

另一种转移切片的方法是用2.3mol/L 蔗糖与2% 甲基纤维素按体积比1:1混合来转移 切片。这两种溶液需要在冰上缓慢混合，而且要现用现配。如果在室温下混合会产生沉淀， 原因可能是由于混匀之前甲基纤维 素的水分被蔗糖吸收所致。由于这种混合液的黏度较低， 因此 比单独用 2.3mol/L 的蔗糖冻结速度快，而且呈白色结晶，在显微镜下比透明的蔗糖更容易观察。注意，当小环周围的液体开始冻结时，就应该立即沾取切片，否则一旦液滴完全冻结将无法沾取切片。切片沾取在这种混合溶液上会保持在沾取时的位置，而不会被过于撑大，而且切片的超微结构比单独用 2.3mol/L 蔗糖沾取时保存得更好。用该混合液转移切片，可以直接将小环液滴上的切片轻轻沾到置于冰上的方华膜碳膜铜网上。该实验所用铜网在制作方华膜时最好捞在封口膜(parafilm)上，然后喷碳。将被覆有方华膜和碳膜的载网连 同封口膜剪下足够大面积，固定在 6cm 的培养皿上，然后将培养皿放在冰上。切片可以直接被转移到这种预冷的载网上。切片完成后用封口膜将培养皿封紧于 4℃ 冰箱中可以保存一到两周。

       (7) 切片质量的检查

将沾有切片的载网切片面朝下漂于去离子水滴上洗掉附在载网上的蔗糖，或者用置于冰上的冷水滴洗掉附着于载网上的蔗糖甲基纤维素混合物。漂洗 5min 后，将载网在空气中自然干燥，然后在电镜下观察检测，切片上没有断裂和小洞并含有所需样品结构时即可用于免疫标记。