免疫标记过程最关键的要点是切片或载网在整个标记过程中不能干燥。如果切片干掉的话，不但会破坏生物样品的超微结构，而且抗体及胶体金颗粒的非特异性吸附以及样品表面 吸附的脏东⻄将无法去除，因此整个标记过程应该在湿盒中进行。而载网没有切片的背面在 整个免疫标记过程中要保持干燥。如果载网意外沉入溶液中，应该立即用纯净水冲洗，然后 用滤纸小心的将载网没有切片的背面吸干，然后将载网先漂浮在水滴上，保证它不会再沉没 进液滴后再继续标记过程。

在整个免疫标记过程中，载网应该漂浮在液滴上， 切片面 (正面)朝向液滴。清洗过程液滴的体积大约为 100-200 μL， 相同条件的载网可以放在同一个液滴上。一抗、二抗孵育 时每 个载网所需体积 5-6 μL 即可。

由于电镜的高分辨特点，免疫标记过程一定要在干净的表面进行，避免脏物和灰尘污染 切片。标记过程中，液滴间载网的转移基本是用小环来完成的。需要注意的是，从清洗液滴 (200μL) 转移到抗体液滴(5μL)以及从抗体液滴转移到清洗液滴的过程需要使用镊子。同时要用滤纸吸掉载网上多余的液体，这样既不会因为附在载网上的液体影响抗体浓度又使抗 体的清洗更加有效。

(1) 冷冻超薄切片的免疫标记步骤:

1. 清除切片中的冷冻保护剂蔗糖及支持物:如果含有切片的载网存放于培养皿 2.3mol/L蔗糖上，那么用移液器加 40 mmol/L HEPES 缓冲液于培养皿的底部，直到液体表面凸起。 蔗糖溶液被 HEPES 稀释后，载网就会沿着凸起的液面漂移到培养皿的边缘，这时再用镊子 将载网转移到 40 mmol/ L HEPES 液滴上，正面朝下清洗 5min。接着用小环把载网转 移 到含有 40 mmol/L HEPES 和 0.01%Tween 20 的液滴上孵育 5min，然后在纯净水上漂洗 一下。如果切片是存放于培养皿中 的明胶上，那么要将明胶加热到 40°C融化，载网在明胶液滴上 保持 10 min。然后转移到 40 mmol/L HEPES 液滴上，其余步骤同上。液滴体积 30-50 μL 即可。 如果沾取切片时使用的是蔗糖/甲基纤维素混合液，清除时需要用冷的纯净 水。首先将封口膜包在培养皿盖子上，然后将培养皿放在冰上预冷。在封口膜干净的表面加 数滴 200 μl 纯净水。再把载网含有切片的正面朝向水滴漂洗 10 min。随后用小环把载网依 次转移到另外两个干净的水滴上，每滴漂洗 10 min。

2. 自由醛基的封闭(quenching)∶ 用小环把载网先转移到室温下的 PBS 液滴上孵育 5min 后，再转移到含有 10 mmol/L 甘氨酸 的 PBS 液滴上孵育 5 min，然后转移到 PBS 液滴上洗 3 次。封闭醛基也可以用含 50 mmol/L 氯化铵 (NH4Cl)的 PBS 溶液在冰上 孵育 10 min，然后转移到 PBS 液滴上洗 3 次。如果使用 0.1-1% 的硼氢化钠(NaBH4)做 为封闭液体，则需要特别小心，因为它会影响超微结构，而且 NaBH4 只有在高 pH 值时才 相对比较稳定，因此实验结果不是很稳定。NaBH4 一定要现用现配，而且 在 15 min 的 孵育过程中最好换一次新鲜溶液。NaBH4 还可以减少戊二醛引起的 自发荧光，因此可用于 冰冻半薄切片免疫萤光标记的前处理。

3. 非特异性抗原的封闭∶ 封闭液可以使用 PBS 配制的 1%冷水⻥皮明胶(cold fish skin gelatin)，1-5% 小牛血清或羊血清，或 0.1-1%乙酰化牛血清白蛋白(BSAc)，在室温 下封闭 5 到 10 min 也可以用 1%的牛血清白蛋白(BSA)和 0.01%Tween 20 进行封闭。我 们一般采用 1% 冷水⻥皮明胶进行非特异抗原的封闭。

4. 一抗标记:一抗标记就是把一抗用封闭液稀释到合适浓度与切片进行孵育的过程。纯 化的 IgG 抗体一般稀释到 2-20 μg/ml。电镜免疫标记通常对抗体的纯度要求比较高，只有 那些在冷冻切片或不经过抗原修复的石蜡切片上进行免疫标记后，光镜检测信号很强而且特 异性很高的抗体，用在电镜免疫标记上才可能获得比较理想的结果。 由于抗体价格普遍较 高，因此每个载网只需用 5 μl 的稀释抗体。抗体孵育过程可以在 37°C或室温下进行。由于使用的抗 体液滴体积很少，孵育过程中液体蒸发容易干掉，因此要求孵育过程在湿盒中进 行。虽然抗体的孵育时间并不是很重要，但最少需要 20min，一般采用室温下孵育 2h。有 些抗原在冷冻切片融化过程中可能会游离出来，也有些可溶性蛋白在固定过程 中可能没有 和醛基起反应而未被固定，因此抗体孵育的时间并非越⻓越好。对于结构蛋白，比如跨膜蛋 白或细胞⻣架结合蛋 白则可能需要较⻓的孵育时间，这样可溶性蛋白的流失反而有助于增 加抗体的穿透性，有利于抗体与结构蛋白的结合。如果抗体孵育需要过夜的话，需要转移到4°C冰箱中。需要注意的是，延⻓抗体孵育时间可能增加非特异性吸附，解决的办法是使用 比常规浓度稀释10倍的抗体。抗体孵育结束后，把载网转移到 PBS 液滴(100-200 μL 每个 液滴)上清洗 6 次，每次 2min。

5. 磷酸盐的去除:免疫标记结束后很重要的一步是去除切片上的磷酸盐和其它离子，以 防在之后的染色过程中磷酸盐和铀反应产生沉淀。可以采用新鲜的，质量好的去离子水，将 载网漂洗于 100μl 的水滴上清洗 4 次，每次 1 min。

       6. 染色和载网的干燥:冷冻切片标记完成后需要染色和包埋保护以防干燥造成假象。采 用醋酸铀(UA)和甲基纤维素 (MC)混合液(即 UA/MC 染液)进行吸附染色，是 1973 年Tokuyasu 和 1984 年 Griffiths 方法的改进。染色液由 0.2%UA 和 1.8%MC 混合而成。通 常我们分别配制 3%UA 水溶液和 2%MC 做为母液，使用前在冰上将 2%MC 和 3%UA 按体积比 9∶ 1 配成混合染液。当然也可以直接配制 0.2%UA 和 1.8%MC 的混合染 液，放于 4°C冰箱避光保存，但储存时间不宜过⻓。我们倾向于用低浓度的 UA，因为高浓度的 UA在增加细胞膜的膜反差的同时也增加了电子密度，使得金颗粒不易被辨识。 染色过程要求 在冰上进行。因为 MC 在低温下黏度降低,可以渗透到切片内部，从而对切片起到包埋保护 作用。而温度升高会导致 MC 聚合。具体做法可以先用封口膜包裹 24 或 96 孔板盖子，置于 冰上预冷，在预冷的封口膜上滴加染液，然后把 载网的切片面朝下漂浮于液滴上，盖好盖 子注意避光并防止液 滴变干。切片染色10 min 后用小环捞取载网。捞取载网的小环需要 专用且保持清洁。用小环捞取载网时须将小环放于载网下方，距离载网有一定的距离，让载 网位于小环的中央，然后向上提起。提前准备好双层滤纸(Whatman 1号滤纸)。将捞有载 网的小环底部与双层滤纸成 45-60°接触(注意是有切片的一面朝向滤纸形成的 夹⻆)，然后 平行向后拉动，使染液在滤纸上形成泪滴样痕迹，于是多余的染液被吸附到滤纸，同时在载 网两面留下很薄的一层染液膜。观察可⻅载网保持在小环的中央，悬在染液的薄膜中。然后 在室温下自然干燥20min。用镊子小心取下干燥后的载网即可进行电镜观察。留在载网上 UA/MC 染液薄膜的厚度取决于 UA/MC 被滤纸吸附的速度。例如平行拉动小环的速度越快， 染液被滤纸吸附得越少，留在载网上的膜就越厚。如果动作过慢则有太多的 UA/ MC 被滤纸吸附，可能导致载网从小环上脱落。