下面以Lowicryl和IR White为例详细介绍低温含水树脂包埋后免疫标记技术。
5.1.Lowicryl包埋
Lowicryl包埋剂包括K4M、K1IM、HIM20和HIM23，它们是由丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯组成的高度交联的包埋剂，由于其低黏度、可以在低温下聚合以及切片相对容易的特点，使其在电镜免疫标记实验中用途非常广泛。K4M 和K11M是极性分子，而HM20 和HIM23 是非极性分子。K4M和HIM20分别可以在-35℃和-70℃进行低温置换；而K11M和HM23则需要分别在-60℃和-80℃进行低温置换，置换和聚合在低温环境下进行可以很大程度上保存抗原的活性。亲水性的K4M和K11M允许样品在不完全脱水(最大含水量可达5%）的情况下进行置换，可以使细胞的超微结构得以较好保存，有利于蛋白质抗原活性的保存，还可以降低免疫标记的背景。
（1）实验材料
①固定液：30g/多聚甲醛，0.1%戊二醛，40g/L蔗糖溶于0.1 mol/L二甲砷酸钠或磷酸缓冲液。
②清洗液在50mL的0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液（pH7.4)中加入4g蔗糖，待蔗糖融化后用去离子水定容到100ml
③醛基封闭液：将75mg甘氨酸溶于10ml清洗液中
④LowicrylK4M的配制
⑤低温紫外聚合箱
（2）样品的包埋过程
①动物组织或培养细胞于固定液中在冰上或4℃固定4h或者过夜。以下过程均4 ℃冰箱或冰上进行；
②弃掉固定液，加人清洗液，清洗4次，每次15min；
③弃掉清洗液，加醛基封闭液孵育30 min。甘氨酸可封闭多余未发生反应的醛基；
④梯度甲醛脱水；
⑤浸透过程在不同比例的甲醛与K4M的混合物中进行；
⑥样品的包埋和聚合要用紫外线能穿透的BEEM胶囊，在360nm紫外线照射下进行；
⑦将紫外线聚合箱的温度设置成-35℃，样品在紫外光下聚合48h；
⑧将紫外线聚合箱的温度设置成室温，继续聚合12h。
5.2 LR White 包埋
（1）实验材料
LR White 包埋剂 (Electron Microscopy Sciences, EMS)，固定液和封闭液与K4M实验所用相同；
（2）LR White包埋实验步骤
①动物组织或培养的细胞在固定液中于4℃固定4h上或者过夜。以下步骤均于4℃下或冰上进行；
②去掉固定液，加人清洗液清洗4次，每次15 min；
③加入醛基封闭液孵育30 min， 甘氨酸可以封闭没有作用的醛基；
④梯度乙醇脱水过程为：30%乙醇，0℃15 min; 50%乙醇，0℃15 min; 70%乙醇，室温下 15 min； 85%乙醇，室温下15 min， 95%乙醇，室温下15 min; 100%乙醇，室温下置换3次，每次15 min；
⑤浸透过程在不同比例的乙醇与LR White的混合液进行；
⑥样品包埋使用明胶胶囊，或者0.5mL的离心小管；
⑦包埋后的样品置52-55℃的烤箱，聚合24h，聚合完成后用清水洗掉残留物即可。
5.3超薄切片、免疫标记和染色
（1）超薄切片:
聚合好的K4M或LR White包埋块呈白色略微泛黄。由于树脂是亲水性的，半薄切片用甲苯胺蓝染色的时间要少于10 s， 否则染色过重将难以分辨结构。超薄切片的切片厚度大约为 90- 100 nm，切片时水槽的水面比常规树脂包埋切片时要低一些。切好的片子应该尽快捞取，不宜在水槽中放置过久。切片要捞在附有方华膜并喷有薄层碳膜的镍网上，储存在切片盒中备用。切 片储存时间不易过长，一般不超过一周，以免抗原失去活性。
（2）切片的免疫标记和染色
切片免疫标记过程的注意事项可参照冷冻超薄切片的免疫标记。标记过程中切记分清载网的正反两面，含有切片的一面为正面，正面始终要朝向液滴。同时在整个标记过程中载网一定不能干燥，否则会增强免疫标记的非特异吸附，因此抗体孵育要在湿盒中进行。湿盒的制作很简单，可用100mm或250mm的细胞培养皿，底部垫一张滤纸，用水将滤纸打湿，在其表面铺上封口膜即可。具体步骤如下:
①将含有切片的镍网在封闭液(1×PBS含有1%BSA,0.05%Triton X-100,0.05%Tween20，pH7.4)上室温孵育 5 min。
②将一抗稀释于抗体孵育液(1×PBS含有1%BSA， 0.05%Tween 20，pH7.4)中。用滤纸吸掉镍网上多余的封闭液，转移镍网到一抗孵育液滴上(每滴5 μL)，室温孵育2h后转移 至4℃过夜。
③抗体孵育结束后，用滤纸吸掉镍网上多余的抗体，置1×PBS液滴(每滴 100-200 μL)上清洗6次，每次2 min。
④将胶体金二抗配制在抗体孵育液中。用滤纸吸掉清洗后镍网上的PBS，转移到胶体金二抗孵育液滴上(每滴5 μL)，室 温孵30min到1 h。
⑤将镍网置于PBS液滴上清洗6次，每次2min。 ⑥用去离子水清洗4次，每次2 min，水滴大小与PBS相同。
⑦染色步骤参照超薄切片染色一章，3%醋酸铀染色4min，柠檬酸铅染色1min。
5.4免疫标记的预期结果
免疫标记的特异性非常重要。如果样品的抗原活性保存良好，同时抗体的特异性又较强，那么预期结果应该是胶体金颗粒主要集中在样品抗原的相应部位，而整个图片中其它部位应该没有或者很少有非特异性吸附的胶体金颗粒。
5.5 免疫电镜双标记技术
上述包埋后免疫标记技术都使用的是间接免疫标记法，就是一抗先反应后再加胶体金二抗。而另一种免疫标记方法是直接免疫标记法，即先制备一抗胶体金复合物，然后用一抗胶体金复合物直接进行免疫标记。直接免疫标记法特异性较好，但需要使用大量的一抗做交联反应，成本很高。间接免疫标记法应用比较普遍，不但一抗的用量少，而且检测过的二抗可应用于同一种属来源的针对不同抗原的一抗。间接免疫标记法也适合于免疫电镜双标记。
做免疫电镜双标记前建议先做每个抗体的单标记，摸索抗体反应的浓度和条件，找到两种抗体的最佳反应条件后，再进行免疫双标记。由于空间障碍的缘故，电镜免疫双标记每种蛋 白的标记率一般都低于相应的单标记率。免疫电镜双标记具体操作方法分为两种:第一种方法和光镜免疫标记的方法类似，先将两个不同种属来源的一抗(例如兔源抗体和鼠源抗体)混 合加入，然后选择两种不同大小的胶体金二抗，这种方法的标 记效率比较低。第二种方法乃两步法，即完成第一次金标记之后，带有切片的载网用含有2%多聚甲醛和0.01%戊二醛的PBS 溶液固定10min，以灭活第一次标记后游离的IgG与蛋白A的结合位点。若选择1%的较高浓度戊二醛后固定，如果第二个 抗原比较敏感时就会影响其标记率。固定完成后用 PBS 液滴清 洗两次，每次1min。然后再重复封闭醛基步骤。用于第二次标记的蛋白A胶体金颗粒 大小一定不能和第一次标记时用的大小一样或相近。由于胶体金的大小并非绝对一致，例如 10nm 胶体金的实际大小成正态 分布，大多数金颗粒10nm，实际大小范围则可能是从8到 12nm，因此如果选用两种大小比较接近的金颗粒做双标记的话将很难区别。实际操作过程中常用的金颗粒组合可以选 6nm 和12nm的胶体金，或者5nm和15nm的胶体金。
一个漂亮的免疫电镜双标记结果需要付出很多努力来摸索最佳条件，比如桥抗体、金颗粒的空间障碍、第一次标记和第二次标记金颗粒的非特异性反应等问题，都需要通过摸索才可能解决。因此我们建议在做双标记的时候，同一个实验需要做不同次序的抗体双标记以及两个抗体的单标记，从而更加全面的观察和分析实验结果。
5.6 注意事项
低温包埋剂的使用
①在混合 K4M 包埋剂时，一定要注意与氧气隔绝，否则包埋剂被氧化后将无法均匀聚合。使用氮气混合包埋剂，并且使整个包埋过程处于氮气环境可以有效防止空气的进入。包埋聚合过程使用干冰也可以使样品在聚合的过程中很好地与空气隔绝。
②使用LR White高温聚合时，注意要盖好包埋小管的盖子隔绝空气。聚合用烤箱的温度一定要设置在52-55℃之间，温度低于52℃，包埋剂将无法聚合;而温度高于55℃会影响样品的抗原活性。
③包埋剂会导致皮肤过敏，尤其Lowicryl系列的包埋剂， 因此混合包埋剂以及包埋操作过程一定要戴双层手套在通风厨中进行，避免吸入及皮肤接触 。
④包埋好的包埋块可以在 -20℃冰箱中密封长期保存。
免疫标记对照实验:
在设计免疫标记实验时，对照的设置非常重要。任何一 个免疫标记的实验都必须有对照实验同时进行，用非特异性抗体做对照实验替代特异性抗体，最好选用同样的IgG亚型。用免疫印记反应来检测抗体的特异性非常重要，但是免疫印迹反应证明特异性结合的抗体并不能保证在切片上就一定可行，其抗原结合位点在切片表面暴露的程度可能有所不同。而有一部分抗体可能并不和游离的抗原结合，但是却能与切片上的抗原结合。
检查抗体非特异性吸附的对照，最好选择不含有目标抗原相同组织或细胞。可以采用细胞转染或基因敲除的方法得到不表达目标抗原的细胞或组织。 当然检测二抗的特异性也很重要，最简单的方法就是设置不加一抗的对照来观察二抗是否与特定的细胞或组织有非特异性结合。
抗体的保存
抗体最好是分装在5 μl或10 μl的毛细玻璃小管中，用火焰将小管的两头封住，然后冻存在-20℃冰箱中。使用时用细砂轮或钻石笔将毛细小管的两头划线掰开，再用移 液器将小管中的抗体吹到抗体孵育液中。
溶液的配制:
①10%牛血清白蛋白(BSA)母液:100 ml去离子水中加入10g的BSA，4℃缓慢搅防止
产生泡沫。将pH值调到7.4，加入0.05%叠氮钠100,000g离心1h，将上清液分装后-20℃冰箱保存。
②2% 甲基纤维素(MC)溶液:配制100mL的2%甲基纤维素溶液，需要先将98mL去离子水加热到90℃然后加入2g甲基纤维素搅拌使其溶解。溶解后转移在冰浴中继续搅拌，迅速使其温度降到10℃，加入去离子水使终体积为100 mL。将此溶液用封口膜密封后， 在 4℃继续低速搅拌过夜。搅拌好的溶液在 4℃静置 3天去除气泡，然后用100,000 g速度4℃离心1 h。上清液分装于4℃避光保存。此溶液的保质期为3个月。
③醋酸铀-甲基纤维素(UA/MC)(pH 4):在90 ml 2% 甲基纤维素溶液中加10 mL 3%的醋酸铀水溶液，使其在冰上慢慢互融后，以10,000 g的速度4℃离心1h。分装上清4℃避光可保存3个月。
