包埋前标记分为两大类， 第一类是培养细胞或组织 表面蛋白的免疫标记，第二类是细胞或组织内蛋白的免疫标记。培养细胞或组织表面蛋白的免疫标记比较简单，类似于光镜免疫标记过程，只是将荧光二抗换成金标记物，免疫反应后再进行常规电镜的固定包埋即可。而细胞或组织内部蛋白的免疫标记比较复杂，下面就相关问题做一些探讨。
细胞或组织内部蛋白的包埋前标记可分为四个步骤：第一步，固定；第二步，破膜；第三步，渗透和免疫反应 (penetration and reaction)；第四步，后固定和包埋。在这四个步骤中，第一步和第二步尤其重要，因为细胞结构破坏越严重，胞内的空间阻碍越小，抗体的穿透和免疫反应就越容易进行。但是，与光镜免疫标记不同的是电镜免疫标记既要求特异性的标记效果，又要求尽量保存细胞的超微结构。当然如果所要标记的蛋白是细胞骨架蛋白的话，细胞结构的保存就显得 不那么重要，可以用去垢剂或有机溶剂尽量多的去除细胞内的 脂类以利于抗体的进入。包埋前标记的第二个关键步骤是破膜，而破膜最普遍的方法就是用去垢剂。
6.1 去垢剂
去垢剂的破膜效果主要取决于它的特性，浓度，温度和离 子强度。免疫组化使用的去垢剂不能选用离子型去垢剂，因为这一类去垢剂可以引起蛋白质的变性而导致抗原活性的丧失。 非离子型去垢剂中使用最普遍的是Triton X-100。如果需要保留较好的细胞超微结 构 ， 可以选用性能比较温和的皂素( saponin) 做为去垢剂 ，有些实验室使用毛地黄皂苷(digitonin)或细菌毒素。我们的经验是对于体外培养的单层细胞可以选用皂素，脑切片或神经组织则更适合用Triton X-100，因为皂素对于神经髓鞘的超微结构破坏很大。
6.2 包埋前免疫标记的基本实验设计
去垢剂法
【以皂素做为去垢剂的包埋前免疫标记基本实验过程】
①固定:通常用1-4%多聚甲醛固定液；
②破膜:用抗体封闭液配制 0.01% 的皂素(W/V)进行破膜反应；
③渗透和免疫反应:在含有一抗和二抗的孵育液中分别 加 0.01% 的皂素进行渗透和免疫标记；
④标记后固定:用戊二醛和四氧化锇双重固定;
⑤最后用树脂常温包埋。
【以Triton X-100 做为去垢剂的包埋前免疫标记基本实验过程】
①固定:通常用1-4%多聚甲醛与低于0.2%戊二醛的混合 固定液进行固定;
②破膜:用0.01-0.05%的TritonX-100进行破膜;
③渗透和免疫反应:用一抗和不同的二抗溶液分别孵育 样品;
④标记后固定:用戊二醛和四氧化锇双重固定;
⑤最后用树脂常温包埋。
（2）冻融法
冻融法通常用于单层培养细胞或厚切片(10-30 μm)，基 本实验过程如下:
①固定 : 通常用高于0 .5%的戊二醛固定很短的时间(几分钟)；
②冷冻保护:10%DMSO或甘油；
③冷冻破膜:用液氮或异戊烷冷冻后在室温融化；
④渗透和免疫反应:用一抗和不同的二抗分别孵育样品；
⑤标记后固定:用戊二醛和四氧化锇双重固定；
⑥最后用树脂常温包埋。
6.3 标记物的选择
（1）辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)
HRP是早期最广泛使用的包埋前标记物，它是一个40KDa的糖蛋白，与DAB反应后在光镜下显示棕色，经过四氧化锇反应后在电镜下呈现加强的电子致密物。由于它的反应是弥散性的，通常整个细胞都呈现阳性反应，可用于低倍下显 示整体细胞内蛋白的分布，因此在神经细胞的标记中被广泛使用 。但是由于其弥散性反应的特点，HRP 很难用于精细结构的电镜免疫标记。
（2 ）纳米金和荧光标记纳米金
胶体金没有一个固定的结构，在溶液中呈悬浮状，而且带有负电荷，用于细胞内标记时比较容易和带有正电荷的蛋白结合而引起非特异性结合。另外由于电镜下可以识别的最小胶体 金为 5nm，早期的包埋前标记只有在少数用 Triton X-100 处理 过的细胞或组织才可以用5 nm胶体金做为免疫标记物。实际 上，即使是5nm的胶体金，其体积还是相对太大，在 细胞质中运动依然有空间障碍。近年来，纳米金和超小金颗粒技术的发展使包埋前免疫标记的精确定位成为可能。 纳米金(nanogold)由金原子有序排列组成，由于金原子的表面被覆了三(芳基)磷配体或卤素离子， 所以纳米金的结构很稳定 ，而且不带电荷。免疫反应后的银增强或金增强反应使纳米金表面覆盖了银或金，形成银包金或金包金颗粒，从而适于电镜观 察。银增强或金增强反应时间的长短决定银包金或金包金颗粒的大小。 荧光标记纳米金是抗体同时结合了纳米金和荧光标记物。荧光标记物可用于光镜定位，而纳米金经过银增强或金增强后可用于电镜下定位。因此，萤光标记纳米金是光电关联技术的理想选择。
