Vasopressin-oxytocin–type signaling is ancient and has a conserved water homeostasis role in euryhaline marine planarians

Aoshi Kobayashi1 , Mayuko Hamada1 , Masa-aki Yoshida2 , Yasuhisa Kobayashi1,3 , Naoaki Tsutsui1,4 , Toshio Sekiguchi5,6 , Yuta Matsukawa1 , Sho Maejima1 , Joseph J. Gingell7 , Shoko Sekiguchi1 , Ayumu Hamamoto1,8 , Debbie L. Hay6,9 , John F. Morris10, Tatsuya Sakamoto1 , Hirotaka Sakamoto

生理过程和行为在一定程度上由大量神经分泌的肽信号分子（神经肽）控制和调节。哺乳动物的抗利尿素（VP）和催产素（OT）是研究最深入、最为了解的神经肽之一。最近提出，基于进化关系，VP和OT家族分子应称为血管肾素（vasotocin）。VP和OT是串联同源的，它们通过复制和次功能化从单个祖先基因演化而来，并最初基于它们在哺乳动物中作为垂体激素的外周作用而被发现，其中VP作为抗利尿激素（ADH）并增加血压，而OT在分娩中引起子宫收缩，在哺乳期引起乳汁排出。这两种肽不仅释放到血液中，还释放到中枢神经系统中，在人类和其他动物中已被证明对情绪、结合和各种社会性行为非常重要。基因组/转录组序列数据的系统发育分析已经揭示了许多原口动物门（脊椎动物和无脊椎动物的脊索动物、腔肠动物和棘皮动物）和原口动物门（如节肢动物、线虫、软体动物和环节动物）中编码VP/OT型神经肽的基因的发现。因此，这种神经肽家族的进化起源可以追溯到双侧动物的共同祖先。昆虫和软体动物中的VP/OT型神经肽在液体稳态中具有类似VP的作用，而水蛭中的VP/OT型神经肽在生殖生理学中具有类似OT的作用。此外，应用反向遗传学技术研究秀丽线虫（Caenorhabditis elegans）揭示了VP/OT型信号在该物种中对基于先前经验的趋化行为的改变和正常交配行为的要求，与哺乳动物中VP和OT的作用一致。然而，直到现在，人们认为在扁形动物中尚未研究VP/OT型信号，这些动物具有简单的双侧对称体结构，但缺乏体腔和体液循环系统。为了在动物界中提供关于这种神经肽信号系统起源和演化的重要新见解，我们在两种海洋扁形动物Stylochoplana pusilla和Notocomplana humilis中证明了VP/OT相关的“platytocin”信号的存在，并研究了这些两栖、广耐盐动物中platytocin的功能。

图. Platytocin和platytocin受体(ptr)的表达模式。(A) 原位杂交显示在颅神经节的两侧有一对platytocin神经元（白箭头）。(B) 免疫组织化学显示两个神经元细胞体（白箭头）和它们的一些突起。刻度尺在(A)和(B)中低放大图像为100微米，在高放大图像中为10微米。 (C) 电子显微镜显示一个含有多个platytocin免疫反应的致密核心囊泡的神经过程。方框显示了五个这样的囊泡（箭头）的免疫金反应的高倍放大图像。刻度尺在低放大图像中为200纳米，在高放大图像中为50纳米。 (D) 原位杂交显示了ptr的整个虫体图像。刻度尺为1毫米。 (E) ptr基因在颅神经节和可能的蘑菇体、咽肌层中的细胞以及分散在包括原肾和生殖区在内的周围组织中的间质细胞中表达（箭头）。刻度尺在(E)中低放大图像为100微米，在高放大图像中为10微米。

免疫电镜

海洋涡虫 (S. pusilla) 用 4% 多聚甲醛固定 和 0.1% 戊二醛的 PBS 溶液在 4°C 下过夜。 甲醇梯度进行脱水，嵌入 LR Gold 树脂（电子显微镜科学，宾夕法尼亚州）中，并在 -20°C 的紫外线灯下聚合 24 小时，如前所述 (45)。 超薄切片（厚度 70 nm）被收集在涂有胶片的镍网上，并用PBS 洗涤多次，然后在50 mM三羟甲基氨甲烷缓冲盐溶液（pH 8.2）中含有2%正常山羊血清和2% BSA的条件下孵育30分钟以阻断非特异性结合。切片在室温下用1:500稀释的针对platytocin的鸡多克隆抗血清孵育1小时。切片用PBS洗涤，然后与1:50稀释的山羊抗鸡IgG的10纳米金颗粒抗体（Abcam，剑桥，英国）孵育1小时。最后，切片用醋酸铀和柠檬酸铅进行对比染色，并在80 kV下使用H-7650（Hitachi，东京，日本）电子显微镜观察。